Né à Fuenllana, en Espagne, en 1488, Thomas passe son enfance à Villanueva de los Infantes, d'où il tire son nom de famille. Ses parents, meuniers, étaient connus pour leurs actes de charité, ce qui a profondément influencé Thomas dès son plus jeune âge. Il poursuit des études supérieures à l'université d'Alcalá, où il excelle, obtenant un diplôme en théologie et devenant un professeur populaire de philosophie, d'arts et de logique. Malgré ses succès académiques, il refuse un poste prestigieux à l'université de Salamanque, préférant rejoindre les frères augustins à Salamanque en 1516, prononçant ses vœux en 1517 et étant ordonné prêtre en 1518.

Il a joué un rôle déterminant dans l'envoi des premiers missionnaires augustins dans le Nouveau Monde, en particulier au Mexique, en 1533, encourageant à la fois les études et les missions au sein de l'Ordre. En 1544, après avoir refusé l'archevêché de Grenade, Thomas est nommé archevêque de Valence. Il accepte ce poste à contrecœur en 1545.

Il mit en place des programmes dans le cadre desquels des fonds provenant des riches étaient destinés à soutenir les pauvres, et il transforma sa propre maison en soupe populaire et en refuge, nourrissant des centaines de personnes chaque jour.

Thomas meurt le 8 septembre 1555 à Valence, à l'âge de 67 ans, des suites d'une angine de poitrine. Il a été canonisé par le pape Alexandre VII le 1er novembre 1658. Sa fête liturgique est célébrée le 22 septembre. Saint Thomas de Villanova est le saint patron de l'université de Villanova en Pennsylvanie, ainsi que d'autres institutions éducatives et paroisses nommées en son honneur.